Il est également possible de se servir de la bioluminescence pour détecter ou quantifier les micro-organismes bactériens dans des produits alimentaires, cosmétiques ou bien de contrôler la stérilité de produits pharmaceutiques. Actuellement, la méthode que nous allons présenter n'est pas encore décrite dans la Pharmacopée (livre qui recense les bonnes pratiques pharmaceutiques), bien qu'elle présente de nombreux avantages par rapport à la méthode « classique ».

 

Le principe :

 

Le but est de déterminer si un organisme viable (vivant donc) est présent dans l'échantillon à tester, qui doit être complètement stérile dans le cas d'une utilisation pharmaceutique (cela peut être une poche de perfusion, un vaccin...). C'est le mode de détection présence/absence.

 

La méthode classique :

 

L'échantillon test est placé dans une étuve avec un bouillon de culture pendant 14 jours à température ambiante, le temps pour les potentielles bactéries présentes de se multiplier. Si au moins un organisme-viable est présent au départ, alors au bout de 14 jours, le bouillon de culture translucide au départ sera brouillé. Au contraire, si l’échantillon était au départ complètement stérile, alors aucun changement ne sera visible à l’œil nu. Cette méthode est officiellement reconnue par la Pharmacopée pour les tests de stérilité.

 

La méthode utilisant le principe de bioluminescence :

 

La bioluminescence peut être utilisée en tant que marqueur de viabilité, car en effet la luminescence, si elle se produit atteste d'une activité enzymatique, et donc de la viabilité d'un organisme. En résumé, si la bactérie brille, elle est viable et donc peut potentiellement se multiplier !

Cette détection se fait en trois étapes :

 

• Filtration

L'échantillon test est versé à travers un filtre en polyester de 2x2 centimètres, ayant une porosité de 0.4 μm, créé avec un bombardement de particules chargées positivement. Les bactéries, si elles sont présentes, son retenues sur le filtre, car elles mesurent entre 2 et 10 μm. Les micro-organismes sont alors disponibles sur la surface.

• Marquage

On utilise ensuite un substrat de viabilité non fluorescent, qui entre dans les cellules. Si l'organisme est viable, alors les enzymes estérases du cytoplasme prennent pour cible le substrat, qui possède des groupes ester.

Le substrat de viabilité est clivé par l'enzyme, et un des produits de ce clivage est un fluorochrome, qui se concentre dans la cellule (ce qui assure au passage de l’intégrité de la membrane plasmique du micro-organisme, qui est également un critère de viabilité avec l'activité enzymatique). C'est un marquage non destructif.

• Scan

Enfin, le filtre est placé dans une machine, sans lumière. A ce moment, deux lasers de 488 nm (dans les bleus), passent sur toute la surface du filtre (parcourant quand même un kilomètre). Si un des lasers rencontre un organisme viable, il excitera la molécule de fluorochrome formé par l'enzyme, qui réémettra une lumière fluorescente verte de 515 nm, détectable par la machine, qui localise la source de la lumière. Il est alors possible de vérifier la localisation du micro-organisme sur ordinateur, puis chaque localisation est observée par un homme au microscope pour s'assurer qu'il s'agit bien d'un micro-organisme et pas d'un résidus moléculaire.

 

Les avantages :

 

Même si elle est beaucoup plus longue à expliquer, cette méthode permet de détecter le moindre micro organisme en moins de 3 heures, ce qui réduit considérablement le coût et la durée du stockage des échantillons. Alors que la méthode classique ne peut que détecter les bactéries quand elles sont en grand nombre après leur culture de 14 jours. C'est une méthode rapide, avec un grande sensibilité et de gros avantages, mais qui n'est pas encore officiellement reconnue par la Pharmacopée.